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Während der Statthalterschaft Pfalzgraf Friedrichs II. begann die Neumarkter Bevölkerung sich mit der Lehre Luthers auseinanderzusetzen. Obwohl der Reformator Martin Bucer vom Pfalzgrafen 1521 als Hofkaplan in Dienste genommen wurde, blieb das Verhältnis des Stadtherrn gegenüber dem neuen Gedankengut zunächst eher zwiespältig.
Die Initiative zur Übernahme des lutherischen Bekenntnisses ging indes von der Neumarkter Bürgerschaft aus. Eigenmächtig bestellte der Rat Prediger und übernahm 1537 gar die Verwaltung der pfarrlichen Einkünfte. Die 1540 vorgetragene Bitte des Rates, das Abendmahl unter beiderlei Gestalt empfangen zu dürfen, gewährte Friedrich II. nur für eine Nebenkirche.
Kurfürst Ottheinrich erließ nach seinem Regierungsantritt 1556 die Kurpfälzische Kirchenordnung, die außer der Unterbindung noch bestehender katholischer Traditionen die vielen Sonderentwicklungen der Reformation vereinheitlichen sollte. Während diese auch für die übrigen Landesteile der Oberpfalz verbindlich wurde, widersetzte sich die nach dem Tode Friedrichs II. in Neumarkt residierende Dorothea der Einführung in ihren Wittumsämtern. Dort herrschte bis zu ihrem Tode die weniger strenge Brandenburgische Kirchenordnung. Auch die im folgenden Jahr begonnene Kirchenvisitation und die damit einhergehende Entfernung katholischer Bilder und Kultgegenstände aus den Kirchen wusste die Kurfürstenwitwe in ihrem Gebiet zu verhindern. Selbst als nach dem Erlöschen der kurpfälzischen Linie Friedrich III. von Pfalz-Simmern als neuer Kurfürst eine calvinisch beeinflusste Lehre trotz heftigen Widerstandes durchzusetzen suchte, blieb Dorotheas Wittum von diesem Vorhaben ausgenommen.
Mit Dorotheas Tod im Jahre 1580 war die Zeit der weitgehend unbehelligten Religionsausübung in Neumarkt zu Ende. Die Wittumsämter fielen an den jüngeren Bruder des Kurfürsten, Pfalzgraf Johann Casimir. Als entschlossener Verfechter des Calvinismus drängte Johann Casimir auf dessen Einführung im lutherischen Neumarkt und ließ zunächst Geistliche und Beamte auswechseln. Während in der Hofkirche dieses Vorhaben sofort umgesetzt wurde, widersetzte sich die Neumarkter Bevölkerung der Calvinisierung ihrer Pfarrkirche St. Johannes, indem sich der Rat der Stadt auf seine alten - allerdings seit 1531 verlorenen - Rechte als Reichsstadt berief.
Lange schwelte der Konflikt zwischen Pfalzgraf und Stadt, und als Neumarkt beim Reichskammergericht 1591 einen kaiserlichen Schutzbrief erwirkte, antwortete Johann Casimir mit der Verlegung der Märkte nach Lauterhofen, Freystadt und Berngau. Dieser wirtschaftlichen Erwerbsgrundlage beraubt, griffen die Neumarkter zu den Waffen. Überraschend kam die Nachricht vom Tode Johann Casimirs, der am 6. Januar 1592 gestorben war. Die Lage hatte sich inzwischen beruhigt, und der neue Landesherr, Kurfürst Friedrich IV. gewährte den Neumarktern neben der Kurpfälzischen reformierten Lehre auch die Duldung des lutherischen Bekenntnisses. Die Bilderstürme von 1596 und 1604 verdeutlichen jedoch den zunehmenden Einfluss des Calvinismus. 1614 wurde schließlich für die Pfarrkirche ein calvinischer Geistlicher eingesetzt.
Ein jähes Ende war der Reformation in der Oberpfalz durch den Dreißigjährigen Krieg gesetzt. Mit der Niederlage am Weißen Berg 1620 verlor Friedrich V. nicht nur die Kurwürde, sondern auch die Oberpfalz. Die Rekatholisierung wurde zunächst mithilfe von Jesuiten und Kapuzinern betrieben. Nachdem aber Maximilian I. von Bayern 1628 die Oberpfalz und die rechtsrheinischen Gebiete der Rheinpfalz zugesprochen bekommen hatte, setzte er der Bevölkerung ein Ultimatum, binnen sechs Monaten zum katholischen Glauben überzutreten oder das Land zu verlassen.